Nature Photonics | 无需荧光标记，新型超分辨显微镜“写生”活细胞

看到感兴趣的照片，我们会情不自禁点开放大。但这种放大不是无限的，Z终我们的好奇心会终止在一个模糊的像素点，无法更清晰。是光的内禀属性造成了这一限制。突破光学衍射J限是科学界很有名的挑战之一，至今仍没有很好的方案。浙江大学物理学院张德龙研究员课题组另辟蹊径，提出“从频域提取空间特征”的思路，发明了一种无标记的超分辨率方法——光热弛豫定位（PEARL）显微镜。PEARL显微镜直接从光热显微镜的探测光束的位置依赖性调制中提取亚衍射J限特征，它不依赖于荧光标记，分辨率可达到120纳米左右。

相关研究成果以“Super-Resolution Imaging of Non-fluorescent Molecules by Photothermal Relaxation Localization Microscopy” 为题1月23日在线发表于Nature Photonics。论文**作者为浙江大学物理学院博士生傅鹏程，通讯作者是浙江大学物理学院张德龙研究员。

寻找光斑里的细节

张德龙的实验室，无菌细胞房紧挨着光学仪器平台。他希望有一天生命体的精细结构能被更清晰、更便捷地观察，这一领域存在一项很有名的挑战：突破衍射J限。

衍射J限是由光的“本性”决定的。光是一种电磁波，由于存在衍射现象，一个被观测的点经过光学系统成像后得到的是一个衍射像，每个物点就像一个弥散的斑。当两个点靠得很近时，弥散斑就像“粘”一起，是一团模糊的图像。1873年，德国科学家阿贝提出了“衍射J限”理论：分辨率的J限近似于入射光波长的二分之一(d=λ/2)。该理论认为，我们观察物体时的分辨率J限，取决于我们用什么波长的光去观察。这类似于我们画画，使用什么样的笔决定了笔触的精细程度，是奔放的泼墨山水，还是细致的花鸟工笔。

图1. 艾里斑与瑞利判据。

（图片来源：https://www.opticsjournal.net/M/Articles/OJbf8d38a472e80dcb/FullText）

可见光的波长通常在380~780纳米之间，根据衍射J限公式可以得出，传统光学显微镜的分辨率J限在200纳米（0.2微米）左右。这个分辨率在观察更小的细胞结构时（例如脂质或蛋白质微滴）就显得捉襟见肘了。也许你会说，可以用更短波长的光来提高成像分辨率，但是短波长的光具有的更高的光子能量，这会对细胞造成严重损伤。

在科学家眼中，J限就是用来突破的。多年来，突破衍射J限已经成为科学界一项公认的挑战，众多科学家提出了超分辨的思路与方法并应用于实际。Z具有代表性的是2014年获得诺贝尔化学奖的超分辨荧光显微技术。借助荧光分子的帮助，科学家将光学显微成像技术的J限拓展到了纳米尺度。

“2014年诺奖为代表的超分辨显微成像技术严重依赖于荧光标记，实际我们看到的是荧光标记，而不是观测对象本身。”张德龙介绍，近年来，摆脱荧光依赖，利用“无标记”实现超分辨成像的科学探索开始成为研究热点，有望能为下一代显微镜提供新的技术方案。在这篇研究论文中，浙大团队提出了他们的全新方案：基于光热弛豫定位显微镜（Photothermal Relaxation Localization Microscopy, PEARL）的非荧光分子超分辨成像系统。

来自海市蜃楼的启发

我们可以把海市蜃楼现象作为了解PEARL的入口。海市蜃楼是光线在在密度不同的气层中穿行时发生折射的结果，就像光穿过透镜，让原本直线传播的光线发生了偏折。张德龙说，PEARL就是试图在被观测物中引入“透镜”，让成像系统通过捕捉电磁波的“偏折”信息，从而获得精确的图像。

分子在遇到特定波长的电磁波时，会吸收电磁波能量并加速分子振动。微波炉就是利用了这一原理对食物进行加热的。当电磁波消失后，加热后的分子就进入能量耗散的放热阶段，这在物理学中被称为光热弛豫。对于科学家想观察的生物细胞来说，虽然组成细胞的同一类分子吸收的能量是一样的，但是他们的光热升温效果在空间上有所区别，总的来说是中心处升温大，边缘处升温小。而当电磁波消失，边缘的热量要比中心的热量耗散得更快。

图2. PEARL成像原理

“我们利用分子的热弛豫现象，将分子吸收能量的特征和其空间位置信息联系起来。通过捕捉不同热弛豫过程的高频差异，对特定的分子进行定位。”张德龙介绍。我们不妨想象夜空里星星“眨眼睛”的情景，星星忽明忽暗地闪烁，实际上是由于大气密度分布不均匀造成光线的偏折造成的。“PEARL技术就好比通过‘眨眼’的快慢程度，来分辨出星星的细节。”

PEARL系统主要由泵浦光和探测光组成。泵浦光是波长可调谐的激光，用于激发特定的分子，它以脉冲的形式聚焦到目标物体上，引发分子光热弛豫；探测光则进行持续的扫描，通过分子的“热弛豫”形成的“热透镜”序列扰动探测光的传播，这种扰动的信号里蕴含着分子的位置和光谱信息。由于“热透镜”的存在，扰动的探测光产生了时间和空间上的变化。这一调制效应带来的突破是：在高次谐波频率上，能够探测到更精细的空间结构，能够突破探测光的衍射J限分辨率。

图3. PEARL成像表征

为活细胞“写生”

在研究中，浙大团队展示了用PEARL来观察酵母细胞中一类细胞器—脂滴。酵母是生物学上广泛使用的模型生物。单个酵母细胞大小约2 - 4 微米，而其内部的脂粒通常只有0.05—0.5微米左右，传统的红外成像方法无法对活细胞进行高分辨观察。他们首次使用PEARL显微镜对酵母细胞进行亚细胞远场红外振动光谱成像。实验不仅成功展示了细胞内的脂滴的分布情况，还测定了它们的大小分布。此外，实验还发现了小尺寸的脂滴和一对蛋白滴（每个约170 纳米）之间有细微的空间分离结构。“我们在酵母的V-PEARL成像中观察到的Z小特征是86 纳米，这是**次用远场红外成像分辨出100 纳米以下的特征。”博士生傅鹏程介绍到。

图4. PEARL哺乳动物细胞成像

图5. PEARL酵母细胞成像

当前，超越衍射J限的光学成像已经形成巨大的突破。与广泛采用的基于荧光的方法相比，无标记成像避免了标记的需要和相关的潜在细胞毒性问题。然而，现有的非荧光的超分辨成像方法往往依赖于饱和效应或者非线性，其普遍适用性受到这些因素的限制。“我们开发的是一种无标记的超分辨率方法，并突破了上述限制。”张德龙强调，该技术不需要特殊的吸收体，因为PEARL依赖于一般的吸收过程，包括电子和振动吸收。“我们相信，PEARL可能为非荧光分子的超分辨率成像开辟了新的途径，在生物学、医学和材料科学领域获得令人兴奋的广泛应用。”

此项工作得到了国家自然科学基金（12074339，32050410293，11934011），量子科学技术创新计划（2021ZD0303200），浙江大学脑与脑机融合前沿科学中心资助项目，中央高校基本科研业务专项资金的支持。

论文链接：

https://www.nature.com/articles/s41566-022-01143-3

原文章链接：http://physics.zju.edu.cn/2023/0214/c39070a2715958/page.htm