激光共聚焦显微镜对于样品的要求及制备方法介绍

激光共聚焦显微镜对于样品的要求及制备方法因样品类型的不同而有所差异。以下是对不同类型样品的要求及制备方法的详细介绍：

一、样品要求

生物样品

荧光表达：对于需要观察荧光标记的样品，应先在荧光显微镜下观察荧光表达是否正常，以确定是否有必要使用激光共聚焦显微镜。

盖玻片厚度：盖玻片的厚度要求≤0.17mm，以确保成像质量。

激发/发射波长：明确样品的激发波长和发射波长，以便选择合适的激光器进行成像。

扫描参数：对于需要重构的样品，应明确扫描区域大小、位置以及Z步进等参数，这些参数会影响测试时间。

样品固定：共聚焦的标本B须贴壁良好，不能悬浮起来。样品需要在载玻片上固定好后送样测试。

抗荧光淬灭剂：做显微成像时，样品需要加抗荧光淬灭剂，并固定盖玻片。

材料样品

样品制备：主要测试偏材料的样品，样品应提前制备好。

尺寸与颜色：拍出来*大面积为1.11×1.8mm到5×5mm范围内，颜色可调。样品的尺寸没有具体要求，但B须平整。

二、制备方法

组织切片样品

组织采集与固定：

采用液氮冷冻法或多聚甲醛（PFA）固定法采集和固定组织。

液氮冷冻法：将新鲜组织放入液氮中保存。

多聚甲醛固定法：将组织块置于4%PFA中进行后固定，时间根据组织块大小和致密程度调整。

冷冻包埋与切片：

使用冷冻切片机将组织切成5~15μm的切片。

冷冻方法包括气体CO2冷冻包埋法、干冰冷冻包埋法、液氮冷冻法和直接冷冻法。

免疫荧光标记：

将冷冻组织切片进行免疫荧光抗体标记。

使用荧光显微镜观察标记是否成功，然后移至激光共聚焦显微镜进行扫描成像。

细胞培养样品

荧光表达载体的构建与导入：

构建绿色荧光融合蛋白表达载体，并将其导入到培养细胞中。

常用的转染方法有磷酸钙转染法和脂质体介导的转染法。

细胞培养与转染：

将培养的细胞铺在含有玻璃片的细胞培养皿中。

在转染细胞后，继续培养1~2天，使GFP标记的蛋白表达水平达到能被荧光显微镜检测的水平。

免疫荧光染色：

使用预冷的PBS缓冲溶液洗涤细胞，去除残留的培养液。

加入4%多聚甲醛（PFA）固定液进行固定。

使用Triton X-100处理细胞，通透细胞膜。

在含有1%BSA的PBS溶液中孵育细胞，封闭细胞和玻璃片。

加入一抗和二抗进行结合，并使用荧光标记的染料进行染色。

*后使用封片剂封片，准备进行激光共聚焦显微镜观察。

三、其他类型样品的制备方法

菌液/污泥/污水类样品：

离心得到菌体沉淀，根据需要进行死活染色或ROS染色。

样品需加冰袋泡沫盒4℃保存，不与冰袋直接接触。

生物膜样品：

样品表面应平整，标出拍摄面。

加冰袋泡沫盒4℃保存，不与冰袋直接接触。

若在爬片上培养生物膜，可将爬片粘于培养皿底部，充满培养基后封口膜密封保存。

植物类样品：

可进行简单冰切及刀切处理。

加冰袋泡沫盒4℃保存，不与冰袋直接接触。

与细胞共培养的样品：

根据样品类型和与细胞的作用方式确定送样量和制样要求。

提供清楚激发/发射波长、拍摄类型（2D/3D）、拍摄倍数等要求。

综上所述，激光共聚焦显微镜对于不同类型样品的要求及制备方法有所不同。在制备样品时，应根据样品的类型和实验需求选择合适的方法和步骤进行操作。