激光共聚焦显微镜拍摄照片有那些技巧

激光共聚焦显微镜（CLSM）以激光作为激发光源，在传统荧光显微成像的基础上，附加激光扫描装置和共轭聚焦装置，通过计算机进行数字化图像采集和处理后，可获得高分辨率光学切片。以下是使用激光共聚焦显微镜拍摄照片的一些技巧：

一、样品制备

样品厚度：待测样品Z大厚度为12mm，盖玻片厚度应小于0.17mm，滑块厚度为0.81.2mm。

细胞培养：固定或活的贴壁细胞应当培养在共聚焦专用培养皿或盖玻片上；悬浮细胞甩片或滴片后，用盖玻片封片，封片剂多采用甘油和PBS（pH8.5~9）混合液（甘油：PBS=9：1）。

二、拍摄设置

镜头选择：为快速、准确找到标本、观察和成像，一般采用由低到高变更物镜（10倍→20倍→40倍/60倍）。使用40倍物镜时，需在镜头中央滴加适量蒸馏水；使用60倍物镜时，需在镜头中央滴加适量共聚焦专用镜油；实验结束后滴加乙醚、乙醇混合溶液（乙醚：乙醇=7：3），并用擦镜纸清理残留镜油。

针孔参数：薄标本（活细胞等）需适当增大针孔（Pinhole）参数，从而有效保护标本，提高亮度，得到反差更好的图像；厚标本（厚组织切片等）则需适当减小针孔参数，从而获得更薄、更准确、更精细的图像。

观察设置：使用目镜观察荧光成像时，尽可能降低汞灯能量并缩短观察时间，避免荧光信号的快速猝灭。

图像拼接：当样品图像的比例远超出显微镜的成像范围，又需要得到一张完整又W美的大尺寸照片时，激光共聚焦显微镜的“自动拼接”功能（Scan Large Image）就显得尤为重要。例如，尼康A1 HD25型激光共聚焦扫描显微镜借助“自动拼接”功能可以生成高质量的25mm视野图像，即将多个载物台位置的成像区域捕捉后进行自动拼接，其扫描区域几乎是传统点扫描器的两倍，实现从单个图像中采集更多的空间信息。

三、参数调节

激光强度和检测器电压：激光强度和检测器电压的增高，都可以相对提升成像亮度。但激光能量过高会对生物样本产生光毒性，并引起荧光染料发生光漂白；而检测器的信号放大有一定限度，当电压值超过一定阈值检测器噪音大幅度增加（假信号，会导致成像模糊）。因此，激光强度和检测器电压调节需要相辅相成，在满足成像速度和分辨率情况下尽可能平衡光损伤、成像亮度和信噪比。

图片亮度和图片背景：成像图片的亮度和背景都是数字信号的改变，可以增加成像的对比度，但对成像分辨率没有改变，可根据实际需求进行调节。需注意避免过曝，过曝的成像片子存在荧光定量分析不准的问题。

扫描速度和平均次数：在保证合适亮度的同时，适当增加激光强度，降低检测器电压值可以提升图片信噪比。此外，可通过调慢扫描速度来提高信噪比，扫描速度越慢，成像质量越高。许多共聚焦设备还配备Average功能，即拍摄多张取平均值，也可以提高信噪比。

扫描分辨率：采样分辨率的大小直接决定是否能达到光学分辨率的极限和Z终成像图片的清晰度。许多共聚焦设备在实验者设置好所有参数后，会有一个推荐值匹配系统Z佳分辨率，以达到设备认为的Z佳成像效果。常规图片采集推荐使用系统默认的采样分辨率，也可根据需求适当调整。

四、光路与拍摄逻辑

光路设置（合适的检测器检测和发射光谱接受范围）、拍摄逻辑（顺序扫描模式和线切线扫描模式）、扫描模式（共聚焦模式、超分辨率模式、快速超分辨率模式）等都会影响成像效果，应根据实验目的和样本特点进行调节。

综上所述，激光共聚焦显微镜拍摄照片的技巧涉及样品制备、拍摄设置、参数调节以及光路与拍摄逻辑等多个方面。掌握这些技巧有助于提高拍摄效率和成像质量。