如何用激光共聚焦显微镜拍摄出合格的照片

使用激光共聚焦显微镜（Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM）拍摄合格的照片，需要遵循一系列步骤和技巧。以下是一些关键的步骤和注意事项：

一、样品准备

样品固定与染色：

确保样品经过适当的固定和染色，以增强对比度和荧光信号。

对于组织切片，控制切片的厚度以获得Z佳的成像效果，通常待测样品Z大厚度为1~2mm。

样品封片：

盖玻片厚度应小于0.17mm，滑块厚度为0.8~1.2mm。

固定或活的贴壁细胞应当培养在共聚焦专用培养皿或盖玻片上；悬浮细胞甩片或滴片后，用盖玻片封片，封片剂多采用甘油和PBS（pH 8.5~9）混合液（甘油:PBS=9:1）。

二、激光共聚焦显微镜设置

激光强度：

根据样本的荧光特性调整激光强度，避免过度激发导致的光漂白。

激光强度的增强是用更高能量的激发光去激发荧光信号。

检测器电压：

检测器光电倍增管可以把光子信号转化为电信号并放大信号，具有极高的灵敏度和较低的噪音。

增加光电倍增管的电压值可放大信号，提高成像亮度。但是检测器的信号放大有一定限度，当电压值超过一定阈值检测器噪音大幅度增加，会导致成像模糊。

图片亮度和背景：

成像图片的亮度和背景都是数字信号的改变，可以增加成像的对比度，但对成像分辨率没有改变。

避免图像过曝，过曝的成像片子存在荧光定量分析不准的问题。

扫描速度和平均次数：

根据需要的图像分辨率和采集速度选择合适的扫描速度。较低的扫描速度可以提高图像质量，但会增加采集时间。

适当增加平均次数（拍摄多张取平均值）可以提高信噪比，改善图片的清晰度。

扫描分辨率：

采样分辨率的大小直接决定是否能达到仪器的光学分辨率极限和Z终成像图片的清晰度。

常规图片采集推荐使用系统默认的采样分辨率，也可根据需求适当调整。

三、拍摄技巧

选择合适的物镜：

为快速、准确找到标本、观察和成像，一般采用由低到高变更物镜（10倍→20倍→40倍/60倍）。

使用40倍物镜时，需在镜头中央滴加适量蒸馏水；使用60倍物镜时，需在镜头中央滴加适量共聚焦专用镜油。

调节针孔参数：

薄标本（如活细胞）需适当增大针孔参数，从而有效保护标本，提高亮度，得到反差更好的图像。

厚标本（如厚组织切片）则需适当减小针孔参数，从而获得更薄、更准确、更精细的图像。

使用自动拼接功能：

当样品图像的比例远超出显微镜的成像范围时，可以使用自动拼接功能生成高质量的大尺寸照片。

四、其他注意事项

定期校准：

定期校准激光器和物镜，确保激光的稳定性和准确性以及物镜的清洁度，以获得Z佳的成像质量。

防光漂白：

使用抗光漂白剂，如DABCO或N-propyl gallate，以减少荧光信号的衰减。

软件更新与维护：

保持软件的Z新版本，以获得Z佳的性能和功能。

按照制造商的指南进行定期维护，包括清洁光学元件和更换消耗品。

生物安全与数据管理：

对于涉及生物样本的实验，遵守相关的生物安全和伦理规定。

确保数据的管理和存储符合科研诚信和隐私保护的要求。

遵循以上步骤和技巧，结合实践中的不断摸索和优化，可以使用激光共聚焦显微镜拍摄出合格且高质量的照片。